在线D时代”，通过生物指标的在线监测，解决了以往只可以通过物理、化学指标间接反应水中微生物活动的局限性，为更全面的水质安全评估和水处理过程真正受控提供了更多有价值的数据。

  生物指标在线水质分析仪器的出现，改变了传统在线水质分析仪器只能对水的物理和化学两种指标进行实时监测的情况，使得更全面的水质安全快速综合评价和水处理工艺过程的物理、化学、生物指标三维控制慢慢的变成为现实。

  在线水质分析仪器是一类专门用于水质分析的自动化分析仪表，仪器可在无需人工介入的情况下实现从水样采集到水质指标数据实时输出的连续运行。在线水质分析仪器具有实时、原位、自动分析的特点，在水污染实时报警、水质安全快速评估及预警特别是水处理工艺过程控制方面都有着重要的应用价值。

  水质指标是表征水的各种不同物理、化学、生物特性及放射性的参数，具体是指水中除水分子之外的其他物质(杂质)的浓度或者由杂质所引起的水的物理、化学、生物特性及放射性的变化结果。以饮用水为例，世界各国，包括世界卫生组织(WHO)的生活饮用水标准，其检测指标都包含了这四类指标的内容，希望能够通过对水的物理、化学和生物及放射性指标的全面获取和分析，对水质做全面评估，达到保证饮用水安全的目的。

  在实际应用中，由于固定水源的水放射性指标正常的情况下变化不大，除了天然矿泉水和生活饮用水、海水，以及核电厂用水及排水外，在总体水质评估以及水处理工艺过程控制方面，被广泛关注和研究更多的物理、化学和生物三类水质指标及其分析技术。以美国清洁水法(Clean Water Act)为例，其第101部分第1条(SECTION 101.(a)就明确说： The objective of this Act is to restore and maintain the chemical，physical， and biological integrity of The Nation’s water(中文：本法规的目的是恢复和保持国家水体的化学、物理和生物完整性);还有，中国的GB/T 33087-2016《仪器分析用高纯水规格及试验方法》中，对高纯水的要求才只有区区6项指标，也是涵盖了物理(电阻率)、化学(氯离子、钠离子、硅酸根、总有机碳或COD)以及生物指标(细菌总数)。

  水质的生物指标是指水中的生物，主要是微生物、藻类以及原生动物及其组成成分(如酶、叶绿素、内毒素、抗性基因等)等存在的数量、活性、以及微生物群落的情况。广义的生物指标还包括生物毒性指标，具体指以生物作为检验测试手段，通过试验生物面对特定水样时某些特性的变动情况来评价水质。

  在线水质分析仪器技术发展的初期，在线水质分析仪器可以测量的水质指标主要只是一些相对简单的物理指标和化学成分指标，如水温、电导率、pH、ORP、溶解氧、浊度、悬浮物浓度等。虽然，随着分析化学、材料科学、电子科学以及计算机技术和通讯技术的发展，在线水质分析仪器技术也得到了快速的发展，可以在线监测的水质指标不断增多，出现了COD、SDI(污染指数)、SiO2、总磷(TP)、总氮(TN)等一大批结构较为复杂的在线水质分析仪器。但是，受制于生物技术的发展水平，生物指标的数据还只可以通过实验室分析方法取得，存在很大的时间滞后性。由于缺失了生物指标的实时变化数据，不能从水的物理、化学、生物学指标这三个维度来全方面了解水质数据的实时变化，在实现对水质变化的预测预警或者对水处理工艺过程来优化和自动控制还是受到了许多的制约。有人把在线水质分析仪器只能测量水的物理和化学指标的此阶段称为在线D时代”。

  在这个时期，为应对生物指标不能直接实时在线监测的局限性，水质科学家和水处理工艺专家们提出了许多间接测量的方法，具体主要有两类：一类是采用水质替代指标，水质替代指标是指一类特定的水质参数，可以综合反映水体的某一类别的水污染情况或水处理过程中某些不能够实现在线监测而且实验室分析也很复杂水质指标的变化。浊度是其中最具有代表的一个水质替代参数，浊度本来是一个湖沼学的概念，原本是指天然水体中的各种浮游生物和悬浮物所造成的浑浊程度，采用肉眼观察或者光学测量方式来做测量。由于浊度可以反映水中泥沙、粘土以及藻类、微生物等有机物质的含量，迅速成为了水质净化处理最重要的关键性工艺参数，同时由于浊度还能反映人的感官对水质最直接的评价，全球各国包括世界卫生组织的饮用水标准都把浊度作为了一个必测的指标，美国饮用水水质标准中，还把浊度和异养菌总数、大肠杆菌、军团菌、病毒等微生物指标一并归属于微生物指标系列中，理由是：浊度对消毒有影响、为细菌生长提供场所。在饮用水标准和水净化工艺过程中，浊度成为了“两虫”(隐孢子虫和贾第鞭毛虫)、耐热大肠杆菌和病毒等致病微生物的替代指标，一种原因是由于引起浊度的颗粒物在某些特定的程度能表征水中微生物数量的多少。另外，由于浊度还能影响水的消毒效果：在其他水质条件相同的情况下，浊度越低，消毒效果越好。更重要的是，由于微生物(尤其是“两虫”)检测十分复杂，误差大、时效性差，难以及时准确地表征净水工艺对微生物的去除效果。以浊度作为微生物替代指标，具有检测的新方法简单、快速、准确等优点，可方便监测水质净化工艺对微生物的去除效果、对工艺运作状况进行评估并对工艺运行参数进行及时优化和调整。

  PS：在线浊度分析仪的测量原理是利用光的散射原理，当光束接触到水中的悬浮物颗粒表面时，将会散射和吸收通过水样的光线度直角时，散射光强度与浊度的大小成线性关系，通过检测器测量散射光强度，同标准比较，就能获得水样的浊度值。现在的在线浊度分析仪，由于其结构相对比较简单、响应速度快、可靠性高，慢慢的变成了了饮用水、工业过程用水等水质净化工艺过程控制最重要的监测设备之一，目前市场上已经有了数十种不同结构、不同量程、不同测试精度、不同安装方法的在线浊度分析仪器产品，能够完全满足从洁净度极高的膜过滤水到高污染、高悬浮物水样浊度的实时监测。(目前市场上主流的在线悬浮物分析仪也普遍采用基于浊度的散射光测量原理，其方法是：利用水中悬浮物含量和散射光强度变化的相关性，通过取一定体积水样，经实验室过滤、烘干后称重的方法获得的悬浮物浓度对仪器进行比对校正，能够得到相对准确的悬浮物监测数据。由于悬浮物浓度是指一定体积的水溶液中所含悬浮物的量，单位是mg/L;必须要格外注意的是，浊度单位NTU(散射光浊度单位)和作为悬浮物浓度单位的mg/L是两个不同的概念，前者是光学单位，后者是质量浓度单位，两者之间不存在数值上的相应或等同关系。悬浮物浓度是污水生物处理法的重要工艺参数，在线悬浮物分析仪在污水处理、工业水处理过程控制方面都很有广泛的应用)

  第二类方法是测量由生物特别是微生物作用引起的水的物理或者化学指标的改变，以此来推断生物指标的变化，从而对水处理工艺来控制。以污水处理为例，目前全世界污水处理的主流工艺大都是采用生物处理，众所周知，污水生物处理作为一个生物反应过程，其核心是水中的微生物活性。准确了解污水中的微生物活性是很重要的，但是在以前通过在线水质分析仪器实时检测微生物活性几乎是不可能完成的任务。水处理专家们围绕污水的生物处理工艺开发了以溶解氧(DO)、氧化还原电位(ORP)、好氧率(OUR)、污泥体积指数(SVI)、MLSS(混合液悬浮固体(活性污泥)浓度)、生物需氧量(BOD)等等一大批和污水中微生物活动相关的物理、化学指标，或者环境条件参数;当然，还有针对厌氧工艺的挥发性脂肪酸(VFA)、碱度等物理、化学指标，这些指标都成为了很重要、在污水生物处理工艺过程控制中起到及其重要的作用的工艺参数，针对这些指标的在线水质分析仪器也都在实际污水处理工艺中得到了广泛应用。尽管这样，由于不能直接获得微生物活性的数据，造成了整个污水处理过程还是处于黑箱运作时的状态，在实际运行中常常还需要依靠运行人员的经验来应对异常水体质量情况的发生。

  饮用水中的消毒剂残留量，是另外一个有价值的实例。饮用水中加入消毒剂的目的是为了杀灭水中的致病性微生物和原虫，同时，为了能够更好的保证在饮用水输配过程中持续保持消毒能力，需要保证水中有一定的消毒剂残留量。目前全球最广泛应用的饮用水消毒剂是氯制剂(包括氯气、次氯酸钠等)，其残余量简称余氯浓度。按照世界卫生组织(WHO)在“饮用水水质准则”(第四版)中的说法：“监测余氯可快速指示原来由直接测量微生物参数所反映的问题。。。。当发现输配水系统中某处很难保持余氯，或者余氯逐渐消失，可能指示水或管道已经因细菌生长而对氧化剂的需求增加。”另外，还建议：“大肠菌群可以用作评价输配系统清洁度、完整性和生物膜存在与否，然而检测太慢且不太可靠，不如直接检测消毒剂残留量。”目前，全球饮用水行业中采用氯消毒的水厂都把余氯浓度作为控制饮用水微生物安全的一个最重要指标，在中国的“生活饮用水卫生标准”中，也规定了自来水出厂时余氯浓度需不低于0.3mg/L;管网末梢的自来水中的余氯浓度也不能低于0.05mg/L。尽管如此，在真实的情况中，由于水中除细菌外，还有别的会消耗余氯的物质，以及大量耐氯微生物的存在，饮用水中还是会出现虽然余氯浓度合格，但是微生物指标超标的情况，给饮用水安全带来风险。同时，由于不能及时得到水中微生物污染的直接信息，在水质有可能出现风险时，为了充分保证水质安全，有时还会采用过量投加消毒剂的做法，既浪费消毒剂，又增加了消毒副产物生成的风险。

  随着生物科学技术的加快速度进行发展，加上水行业对水中以致病细菌、病毒及抗性基因等为代表的生物污染物的日益重视，新兴的生物科学技术和传统在线水质分析仪器技术在水质分析领域得以结合，在线水质分析仪器技术取得了突破，对生物指标进行实时在线监测得以实现，通过在线分析技术实时从物理、化学、生物3个维度检测水质指标，全面描述水质状况，对水质安全进行快速综合评估，也使得水处理工艺过程多维度自动控制成为可能，在线水质分析仪器技术开始步入了“3D时代”。

  生物技术的采用可以直接测量待测水样中的生物组成成分和数量，如藻类浓度或者微生物含量等，也能够最终靠测量水中微生物的代谢产物等来获得微生物活性的信息。到目前为止，前一种方式中比较重要的新产品有藻类在线分析仪、在线流式细胞仪等;后一种方式中有在线大肠杆菌分析仪、碱性磷酸酶(ALP)法细菌总数分析仪、三磷酸腺苷(ATP)在线分析仪等。

  藻类在线分析仪是利用以叶绿素为代表的光合色素，在激发光下会发出荧光，荧光的强度和藻类中叶绿素的含量相关，进而和水中藻类总量相关;而且同一门类的藻类中的光合色素对特定波长的激发光具有相近的相应荧光光谱，因为这种特征色素的存在，不同门类藻类的荧光光谱之间具有较显著的差异，根据藻类各自的特征光谱及其强度，可以对藻类进行分类及对不同门类藻的浓度进行定量检测。在线流式细胞仪(FCM)是将实验室流式细胞仪应用于水质在线分析的一种技术，仪器通过检测多种散射光和荧光信号，实现在细胞分子水平上对待测对象(细胞、RNA\DNA、蛋白质等)的物理和生物学特征的快速检测，在先进算法和运算能力的支持下，对这些复杂和数量众多的信号加以定量处理;流式细胞仪测量总细胞数(TCC)，已经被瑞士列入饮用水标准分析方法。目前流式细胞术在线细菌分析仪，可以快速测量水中细菌总数、藻类等指标，并能通过不同的荧光染色材料对活细菌和死细菌进行区分，获得大量有价值的水中微生物信息。

  目前，采用水下3D显微成像镜头，在人工智能、图像识别技术的支持下，实时连续获得水体中的藻类数量、分类情况等信息;或者对污水生物处理过程中的原虫以及微生物种群、活动进行连续监测，帮助运行人员实时控制和优化污水处理工艺也开始得到应用。

  经过测量水中微生物代谢产物的方式来及时获得微生物活性的信息，也是目前发展非常迅速的在线分析仪器技术。新陈代谢是活生物体最基本的标志，它反映了细胞从环境中获取能量的能力，生物体新陈代谢都会通过酶来进行。某些生物体或生物群落会产生特异性的酶，测量这种特异性酶做测量，就能够获得目标生物体代谢活性的信息，并计算出活的目标生物体的浓度。由于实验室微生物分析方法需要人工培养，耗时长，在涉及水处理工艺过程控制，以及水质超标报警、水质安全预警的需求时，在线水质分析仪器快速、自动的优势就得到了充分的体现。以大肠杆菌分析为例，目前有两种方式的在线大肠杆菌分析仪，一种是酶底物法，酶底物法基于标准的实验室方法，其原理是利用水中大肠杆菌经过培养在代谢过程中产生的β-葡糖醛酸酶，分解培养基中的特定底物，产生荧光，荧光强度与水中大肠杆菌的含量有数学相关性，经过测量荧光强度就能够计算出大肠杆菌浓度。由于酶底物法方法仍然需要培养，测量时间会受待测水样大肠杆菌浓度的影响，常常要从4-18小时，目前这种方法的在线分析仪器还只能用于水质自动分析，不能够满足过程控制的需求;另一种是酶活力直接测量法，通过建立酶活力的标准曲线，直接测量水中β-葡糖醛酸酶的活力，酶活力的大小与大肠杆菌的含量高度相关，进而得到水中大肠杆菌的浓度;由于酶活力直接测量法不需要对水样进行培养，可以在15分钟内完成一次测量。

  碱性磷酸酶(ALP)法细菌总数分析仪是利用细菌碱性磷酸酶活力与细菌总数的相关性，通过直接测量待测水样中的碱性磷酸酶活力，获得水中细菌总数的相对数据，并通过和实验室传统培养方法的测量结果进行比对校准，进而实现针对特定水样的细菌总数的在线实时监测，这种原理的在线水质分析仪器，其测量周期也只需要15分钟，能够完全满足实时监测和水处理工艺过程自动控制的需求。

  三磷酸腺苷(ATP)在线分析仪是测量三磷酸腺苷 (ATP)这种存在于所有活细胞内的能量物质，研究表明，水中ATP含量与活细胞数量呈正相关关系，通过测定 ATP含量就能间接反映水中的活性生物量。其测量方法是：基于生物发光技术，细胞在裂解后释放出ATP，在荧光素酶的作用下，试剂中的荧光素与ATP发生反应，最终释放出固定波长的荧光，荧光强度与ATP浓度呈特殊的比例关系，利用荧光检测计检测得到荧光信号，和已知的ATP校准曲线对比，就可得到ATP浓度，进而得到水中活性生物量的数据。这种方法试剂中的荧光素酶，需要在低温下保存，否则酶活力会受一定的影响，进而影响测量结果的准确性，要求在线分析仪器内置制冷设备，仪器结构稍显复杂。

  在线D时代”，通过生物指标的在线监测，解决了以往只可以通过物理、化学指标间接反应水中微生物活动的局限性，为更全面的水质安全评估和水处理过程真正受控提供了更多有价值的数据;随着更多生物指标实现在线监测，和在线监测的物理、化学指标协同作用，水处理过程的微生物污染控制和生物法水处理工艺都将不再是黑箱控制，水处理的效率和安全性将会得到进一步的提高。

  关于在线生物毒性仪，前面提到过，广义的生物指标还包括水的生物毒性，具体是以某种生物作为实验手段，测试其对特定水体的反应来衡量水的综合毒性。由于水中的有毒物质种类非常之多，数量巨大，几乎不可能通过物理或者化学手段分析穷尽这些物质;而且，即使知道了这些物质分别在水中的含量和毒性，也会由于这些物质在水中还存在着诸如协同、拮抗、相加、独立等多种不同的相互作用方式，对水的毒性产生一定的影响，导致没办法通过物理、化学的方法来确定最终水的毒性。这时就需要采用生物体来直接评价水的综合毒性。

  被用作毒性试验的生物主要有：发光细菌、鱼、大型蚤、藻类、硝化细菌等，微生物燃料电池(MFC)在毒性测试的应用也有报道。目前，采用上述这些生物的在线毒性分析仪器都有了成熟的产品和市场应用。

  其中，发光细菌法测量生物毒性分析是一种十分成熟的方法，在国际标准化组织(ISO)和中国都有实验室测量的标准方法，标准代号和名称分别是：ISO11348-3：2007 《Water quality — Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) — Part 3: Method using freeze-dried bacteria》;以及GB/T15441-1995 《水质急性毒性的测试 发光细菌法》，具体方法是;利用某些自体发光的细菌，如明亮发光杆菌、青海弧菌、费氏弧菌等，在遇到毒性物质时，细菌会死亡造成发光强度减弱，其相对发光度与水样毒性组分浓度呈显著负相关(P≤0.05)，因此能通过以一定量的发光细菌作为测试试剂，测量其在特定水体的相对发光度，以此表征水样的毒性水平。现有的发光细菌法在线生物毒性分析仪，就是把上述实验室分析方法及步骤通过自动控制完成从水样采集、输送、试剂添加到结果计算的全过程自动分析，以此来实现对待测水样综合生物毒性的实时在线监测。目前主要有两种进样方式的发光细菌法在线生物毒性分析仪，一种是采用实验室分析仪常用的批次进样方式，一次进样，完成一个分析流程后再进下一个水样，由于这种仪器分析的是非连续的水样，有可能是在水体发生突然变化时，丢失部分水样的真实数据。另一种是连续进样方式，水样连续的进入反应器和发光细菌试剂混合，仪器连续检测发光强度变化，这种进样方式能保证在线生物毒性仪分析的是连续水样，相比批次进样能更及时连续地反映水体毒性的变化。

  正如文中所提，水中生物指标的实时变化数据，在实现对水质变化的预测预警或者对水处理工艺过程来优化和自动控制方面是至关重要的。在“2D时代”，受制于生物技术的发展水平，人们大多采用水质替代指标或是测量由生物特别是微生物作用引起的水的物理或者化学指标的改变等间接测量手段来推断生物指标的变化，从而对水处理工艺进行控制。

  近年来，对生物指标进行实时在线监测得以实现，水质在线D时代”，一种原因是得益于生物科学技术的加快速度进行发展;另一方面则是因为水行业对水中以致病细菌、病毒及抗性基因等为代表的生物污染物的日益重视，这一点在我国新冠肺炎防疫工作中得到了体现。

  本网关注发现，在2019年年底爆发的新冠肺炎疫情重大公共卫生事件中，水中微生物的检测/监测为阻断疫情传播入口发挥了重要的作用，同时，这次疫情暴露出我国在城市公共环境治理方面还存在短板死角，亟待补齐。中央、国家主席、主席、中央全面深化改革委员会主任习在2020年2月14日下午主持召开了中央全面深化改革委员会第十二次会议并发表重要讲话。他指出，要改革完善疾病预防控制体系，坚决贯彻预防为主的卫生与健康工作方针，坚持常备不懈，将预防关口前移，避免小病酿成大疫。技术的发展加上市场的需求，水中微生物的检测/监测或将迎来良好的发展机遇。

  为此，仪器信息于2020年3月17日组织召开了“水中微生物检测技术及热点应用”专题网络研讨会，邀请多位专家作精彩主题报告，为有关技术人员提供线上互动交流平台，加强学术交流。

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